Paris, 20 mars 2012

Une protéine à la fluorescence inégalée pour illuminer les cellules de l'intérieur

Des scientifiques du CNRS, de l'ESRF, du CEA, de l'Université Joseph Fourier et des Universités d'Amsterdam et d'Oxford ont réussi à créer une molécule capable d'éclairer l'intérieur des cellules vivantes avec une lumière turquoise, trois fois plus brillante qu'auparavant. Cette nouvelle molécule permettra d'étudier les interactions entre protéines à l'intérieur de cellules vivantes avec un niveau de sensibilité inégalée : une avancée en imagerie cellulaire qui fait l'objet d'une publication le 20 mars 2012 dans Nature Communications.
Les protéines fluorescentes cyan (CFP) sont très utilisées en biologie cellulaire car elles rendent visibles, comme dans un film, les processus à l'œuvre à l'intérieur d'une cellule et les changements de conformation des molécules biologiques. Elles permettent, depuis le début des années 1990, d'observer des processus auparavant invisibles, comme le développement des cellules nerveuses dans le cerveau ou la propagation des cellules cancéreuses dans le corps. Cependant, ces molécules ont longtemps souffert d'un signal de fluorescence faible, ne convertissant à peine que 36 % de la lumière bleue incidente en lumière cyan (1).

Afin de pallier ce problème et d'améliorer la technique, l'équipe dirigée par Antoine Royant de l'Institut de Biologie Structurale (CNRS/CEA/Université Joseph Fourier) et les chercheurs des Universités d'Amsterdam et d'Oxford et de l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) ont collaboré à un travail de recherche en trois étapes.

D'abord, l'équipe de Grenoble, avec celle d'Oxford, a décelé grâce aux rayons X du synchrotron ESRF, d'infimes détails qui ont permis d'expliquer comment les CFP stockent l'énergie incidente avant de la réémettre sous forme de lumière fluorescente. Les chercheurs ont produit des cristaux microscopiques de ces CFP améliorées, les ont soumis aux rayons X du synchrotron ESRF, et ont ainsi pu inspecter le chromophore, le « coeur » de la CFP à l'origine de l'émission de lumière et donc responsable de l'efficacité de fluorescence. Ils ont pu comprendre la fonction de différents atomes individuels à l'intérieur des CFP et identifier la partie de la molécule qui avait besoin d'être modifiée pour augmenter le signal de fluorescence.

En parallèle, l'équipe d'Amsterdam dirigée par le Professeur Theodorus Gadella s'est servie d'une technique de criblage innovante pour étudier des centaines de molécules CFP modifiées, mesurant leur durée de vie de fluorescence au microscope, afin d'identifier les protéines dont les propriétés avaient été améliorées.

Le résultat de cette conception rationnelle est une nouvelle CFP, appelée mTurquoise2. En combinant leurs efforts de biologie structurale et cellulaire, les chercheurs ont pu montrer que mTurquoise2 avait un niveau de fluorescence de 93 %, jamais atteint jusqu'ici pour ce type de protéine.

Cette nouvelle molécule permettra d'étudier les interactions entre protéines à l'intérieur de cellules vivantes avec un niveau de sensibilité inégalé. La haute sensibilité est cruciale pour les réactions rapides où le temps nécessaire pour l'accumulation de la lumière fluorescente est très court et dans des processus biologiques où quelques protéines seulement sont impliquées et les signaux extrêmement faibles. Grâce à cette nouvelle protéine, de nombreuses recherches pourront être réalisées avec des niveaux de précision et de détail jamais égalés. Par cette nouvelle approche basée sur la connaissance de la dynamique structurale de la protéine, les chercheurs espèrent maintenant concevoir des protéines fluorescentes améliorées avec des couleurs différentes pour d'autres applications.

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Biologie de synthèse

Les méthodes spécifiques aux biotechnologies "classiques" sont artisanales : on extrait un gène spécifique du patrimoine génétique d'un organisme naturel et on le transfère dans un autre organisme, qui peut produire la protéine associée à ce gène avec une vitesse et un rendement supérieur.

C'est en combinant les concepts de la biologie des systèmes, dont le but est de comprendre les systèmes biologiques complexes dans leur globalité, avec les biotechnologies, qui ont des objectifs technologiques, que la biologie de synthèse a vu le jour. Cette dernière vise non seulement la synthèse directe d'un gène par des technique chimiques, de génie génétique ou spécifiques aux nanotechnologies, mais aussi l'utilisation des méthodes issues des sciences d'ingénieur comme l'informatique ou l'automatique pour concevoir de façon rationnelle de nouveaux systèmes biologiques.

Plusieurs stratégies existent :

 L'approche dite "top-down" consiste à modifier un système biologique naturel pour obtenir un système plus simple, plus facile à comprendre et à manipuler. On peut par exemple prendre une bactérie, lui retirer une bonne partie de ses gènes, en ne gardant que le minimum nécessaire à sa survie en conditions de laboratoire, comme c'est le cas du projet "Mycoplasma laboratorium" de l'Institut J. Craig Venter. Un autre exemple est le projet "Synthia", porté par le même laboratoire, où l'ADN naturel de la bactérie a été entièrement remplacé par un ADN synthétique.

 La démarche opposée, dite "bottom-up", consiste à définir des briques élémentaires ayant des fonctions bien définies puis à les assembler pour fabriquer des systèmes biologiques sur mesure, comme dans un jeu de lego. Cette stratégie est adoptée dans le cadre du concours de biologie de synthèse iGEM, hébergé par le MIT, auquel participent chaque année un millier d'étudiants.

 On peut aller encore plus loin et réaliser des "proto-cellules", vésicules dotées d'une paroi semblable aux membranes des cellules vivantes, qui peuvent absorber sélectivement de petites molécules et les transformer à l'intérieur, grâce à une machinerie cellulaire simple. Les proto-cellules peuvent réaliser diverses fonctions, par exemple détecter et signaler une anomalie de santé, avant l'apparition des symptômes. En particulier, des proto-cellules lancées dans le système digestif et éliminées naturellement peuvent être utilisées comme méthode non-invasive de diagnostic.

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paris, 10 février 2012

Dengue : un anticorps prometteur caractérisé

Des équipes de chercheurs de l'Institut Pasteur, du CNRS et de l'Inserm viennent de déterminer, pour la première fois, la structure et le mode d'action d'un anticorps capable de neutraliser simultanément les quatre formes du virus de la dengue, chez la souris. Ce travail représente une avancée majeure pour les recherches visant à mettre au point un vaccin efficace contre cette maladie. Cette étude est publiée ce jour dans la revue Structure.
Les difficultés rencontrées lors de l'élaboration d'un vaccin anti-dengue proviennent de la variabilité du virus de la dengue, qui compte quatre formes différentes. Appelées sérotypes, elles sont dotées de propriétés bien spécifiques à chacune. Les scientifiques ont déjà démontré que protéger un individu contre l'une de ces quatre formes, augmentaient non seulement les risques d'infections par les trois autres, mais également les risques de développer des formes sévères, voire mortelles de cette maladie. D'où la nécessité pour les chercheurs de mettre au point un vaccin ou un traitement ciblant les quatre sérotypes.

   Des équipes de chercheurs de l'Institut Pasteur, du CNRS et de l'Inserm, coordonnées par Félix Rey (1) et Hugues Bedouelle (2) (Institut Pasteur/CNRS) ont réussi à caractériser pour la première fois un anticorps capable de neutraliser, chez la souris, les quatre formes du virus de la dengue. Grâce à des analyses comparatives en cristallographie à haute-résolution, l'équipe de Felix Rey a pu visualiser la façon dont l'anticorps se fixe sur le virus, à travers les structures spécifiques de reconnaissance de chacune de ces formes.

Ces équipes ont également montré que cet anticorps reconnaît une protéine de surface du virus, avec plus ou moins d'affinité et de pouvoir neutralisant selon qu'il s'agit des sérotypes 1, 2, 3 ou 4. L'anticorps induit pour chacun d'eux le même mécanisme d'inactivation : la liaison de l'anticorps avec cette protéine de surface perturbe de façon irréversible l'architecture du virus. Ce changement structural le met définitivement hors d'état de nuire.

Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives pour la mise au point d'un vaccin efficace contre la dengue capable de protéger contre toutes les formes du virus de la dengue.

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Paris, 23 décembre 2011

Une bactérie produisant des nano-aimants de greigite enfin cultivée en laboratoire
Un consortium international, impliquant des chercheurs du CEA1, du CNRS et des universités de la Méditerranée et Pierre et Marie Curie, ainsi que des chercheurs du DOE2 à Ames (USA), des universités du Nevada (USA), de Rio de Janeiro (Brésil), de San Luis Obispo (USA) et de Pannonia (Hongrie), vient de caractériser un nouveau groupe de bactéries magnétotactiques (MTB) capables de produire des nano-aimants de magnétite et de greigite3 en fonction des conditions environnementales. La caractérisation phylogénétique, physiologique et génomique de l'une de ces bactéries, nommée Desulfamplus magnetomortis BW-1, a été possible grâce à son isolement en culture et a permis ainsi d'identifier deux groupes de gènes essentiels à la formation des nano-aimants. Le premier groupe interviendrait dans la formation de nano-aimants de magnétite tandis que le second serait impliqué dans la production de nano-aimants de greigite. C'est la première fois qu'une bactérie magnétotactique produisant des cristaux de greigite est isolée en culture. Il s'agit d'une avancée majeure permettant d'élargir le champ des applications biotechnologiques de ces nanoaimants. Ces résultats sont publiés dans la revue Science du 23 décembre 2011.
Les bactéries magnétotactiques (MTB) possèdent un organite unique, appelé magnétosome, constitué de nano-cristaux magnétiques de greigite (Fe3S4) ou de magnétite (Fe3O4). Alignés comme une aiguille de boussole, ces nano-cristaux leur permettent de nager le long des lignes de champs magnétiques à la recherche du milieu le plus favorable pour leur croissance. Bien que très largement répandues dans la nature, les MTB restent difficiles à cultiver en laboratoire. Seules quelques souches de ces bactéries, capables de produire uniquement des nano-aimants de magnétite, ont pu être cultivées. Quant aux bactéries magnétotactiques formant des nano-cristaux de greigite, les chercheurs n'avaient à ce jour jamais réussi à les isoler.

Pour répondre à ce challenge, des chercheurs du CEA, du CNRS, des Universités de la Méditerranée et Pierre et Marie Curie, en collaboration avec leurs partenaires américains, brésiliens et hongrois, ont réalisé des prélèvements au Nevada et en Californie dans des milieux aquatiques constitués d'eau douce ou d'eau saumâtre. Ils ont montré la présence de bactéries magnétotactiques (MTB) produisant à la fois de la greigite et de la magnétite dans ces milieux. De plus, l'analyse phylogénétique4 de ces bactéries leur a permis d'identifier deux nouveaux genres inconnus appartenant à la classe Deltaproteobacteria, l'une des classes bactériennes les plus étudiées. Grâce à l'analyse d'échantillons provenant d'un bassin saumâtre de la vallée de la mort en Californie, les chercheurs ont réussi à isoler et à cultiver une bactérie, nommée Desulfamplus magnetomortis BW-1, appartenant à un de ces nouveaux genres bactériens et capable de produire à la fois de la greigite et de la magnétite. De manière générale, chez les MTB, la formation des magnétosomes est contrôlée génétiquement par un groupe de gènes, les gènes mam, qui sont spécifiques des bactéries magnétotactiques (MTB). Le séquençage du génome de la bactérie BW-1 a confirmé l'existence de ces gènes mam chez cette nouvelle espèce. Toutefois, chez BW-1, ces gènes s'organisent différemment et forment deux groupes de gènes distincts dans le génome. Le premier groupe est homologue aux gènes permettant chez les MTB la formation de nano-aimants de magnétite. Le second partage le plus de similarités avec des gènes impliqués dans la formation de nano-aimants de greigite. La formation des magnétosomes de magnétite et de greigite, chez la bactérie BW-1, serait donc régie par ces deux groupes de gènes dont l'expression serait régulée en fonction des conditions environnementales.

Un grand nombre d'applications biotechnologiques sont à l'étude pour l'utilisation des nanocristaux de magnétite produit par les MTB, notamment pour l'imagerie par résonnance magnétique, la dépollution ou l'utilisation de magnétosomes modifiés comme catalyseurs. La première mise en culture de cette nouvelle bactérie produisant de la greigite est une avancée majeure qui va permettre de caractériser ces nouveaux nanoaimants et d'élargir le champ des applications potentielles des magnétosomes.

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